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  • Q:什么是adeno-associated virus (AAV)

    维真回答:腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科,是一类小的、二十面体、无包膜病毒。需要辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒参与复制。AAV不编码自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。 AAV是一种复制缺陷病毒,复制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。
  • Q:什么是recombinant AAV(rAAV) & helper free rAAV?

    维真回答:重组AAV(rAAV)是人工改造的AAV,没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。
    rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因或结构,这使rAAV具有4.1-4.9 kb的包装容量。
  • Q:使用AAV有哪些生物安全性要求?

    维真回答:可在生物安全1级(BSL-1)实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外,应在生物安全2级(BSL-2)实验室封闭处理具有生物危害性的材料。
  • Q:重组AAV 安全吗?

    维真回答:迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。
  • Q:重组AAVs的克隆容量有多大?

    维真回答:AAV具有~4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时,包装效率显著降低。例如,对于过表达来自cDNA的基因,CMV-poly(A)信号元件约为1KB,因此最大可包装的cDNA长度约为3.2kb,如果共表达GFP(约0.8kb),则可包装的容量大约为2.4kb。
  • Q:哪些血清型的 AAV 可供选择? 我该选用哪种AAV呢?

    维真回答:目前为您提供的 AAV 血清型为 AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。

    同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

  • Q:使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?

    维真回答:rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。 
  • Q:AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?

    维真回答: 纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。
  • Q:订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? & 客户收到的产品是怎样的?

    维真回答:您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。
    基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。
    通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液 1×10^12-13 VP /ml。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。
  • Q:AAV常见问题解答

    1.什么是Adeno-associated virus (AAV) &重组 AAV(rAAV) & helper free rAAV?

    腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科,是一类小的、二十面体、无包膜病毒。AAV是一种复制缺陷病毒,复制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。AAV不编码自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

    重组AAV(rAAV)是人工改造的AAV,没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因或结构,这使rAAV具有4.1-4.9 kb的包装容量。

    2.使用AAV有哪些生物安全性要求?

    可在生物安全1级(BSL-1)实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外,应在生物安全2级(BSL-2)实验室封闭处理具有生物危害性的材料。

    3.重组AAV 安全吗?

    迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

    4.重组AAVs的克隆容量有多大?

    AAV具有〜4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时,包装效率显著降低。例如,对于过表达来自cDNA的基因,CMV-poly(A)信号元件约为1KB,因此最大可包装的cDNA长度约为3.2kb,如果共表达GFP(约0.8kb),则可包装的容量大约为2.4kb。

    5.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种AAV呢?

    目前为您提供的AAV 血清型为AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。

                                                            

     

    AAV

    Serotype

    Muscle

    Hepatocyte

    Pulmonary

    Brain

    Retinal pigmented epithelium

    Pancreas

    Kidney

    AAV1

    X

     

     

    neuons and glial cells

    X

    X

     

    AAV2

     

     

     

     

     

     

    X

    AAV5

     

     

    lung alveolar cells

    neuons and glial cells

    X

     

     

    AAV6

    X

     

    X

     

     

     

     

    AAV7

    X

     

     

    neurons

    X

     

     

    AAV8

    X

    X

     

    neurons

    X

    X

     

    AAV9

    X

    X

    X

     

    X

    X

    X

     

    请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

    6.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?

    rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

    7.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?  

    纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。

    8.订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?

    您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

    基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

    通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /ml。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。

  • Q:贵公司出售的pENTER-ORF中克隆的ORF序列与NCBI上公布的该基因的序列完全一致吗?

    维真回答由于部分基因含有SNPs,因此,我们pENTER-ORF穿梭载体中克隆的ORF序列并不总是与NCBI上公布的该基因的序列完全一致,有些基因的序列与NCBI上公布的序列会有个别碱基的出入(有些碱基的突变为有义突变,有些为无义突变)。如果您需要与NCBI上公布的基因序列完全一致,我们可以提供相应的突变调整服务
  • Q:从贵公司购买的pENTER-ORF穿梭载体是否可以直接用于蛋白检测?

    维真回答:可以直接用于蛋白检测,并且我们在ORFC’端融合了FlagHis标签,便于蛋白的检测和纯化。
  • Q:贵公司的慢病毒载体能筛选稳定转染的哺乳动物细胞吗?

    维真回答: ViGene生物的慢病毒载体是第三代的慢病毒载体,您可以选择pLent-GFP-CMVpLent-puro-CMV载体,载体上的puromycin嘌呤霉素标签或GFP绿色荧光蛋白可以进行稳转细胞株的筛选。
  • Q:在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工具?

    A:您应先考虑以下几点:
    1.外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达
    2.需转染分裂细胞还是非分裂的细胞
    3.对于靶细胞的潜在免疫原性
    4.病毒用来进行体内还是体外基因传递腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。它适用于体内和体外基因传递,转染效率高,对外源基因瞬时表达量高。但相对于其他病毒载体系统,腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性.

  • Q:在操作和使用腺病毒和慢病毒载体时应注意哪些安全性问题?

     维真回答:ViGene生物的腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒,E1E3基因缺失。ViGene生物的慢病毒载体是第三代的慢病毒载体, 将3’LTR的增强子功能进行了缺失,形成了所谓的“自灭活”,即该病毒基因组整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒;5’LTRU3区替换成了CMV,是最安全的慢病毒载体。病毒实验应在BL2生物安全二级实验室操作,操作时应始终佩戴手套。
  • Q:实验室前期一直在使用脂质体的方法进行转染细胞,但转染效率很低,现在想通过病毒的介导提高转染效率,不知道应该选择腺病毒还是慢病毒?

     

    维真回答:(1)腺病毒和慢病毒均有各自的优缺点(见下表),应根据试验目的选择相应的病毒类型。(2)不同病毒在不同细胞中的感染效率存在差异,为帮助您选择感染效果最佳的病毒或血清型病毒,我们公司最新研发出了“GFP-病毒检测试剂盒,可迅速、准确地帮助您寻找到最适合您细胞的病毒载体。

    腺病毒

    腺相关病毒

    慢病毒

    基因组

    dsDNA

    ssDNA

    ssRNA(+)

    囊膜

    基因组大小

    38-39kb

    5kb

    9kb

    感染类型

    分裂和非分裂细胞

    分裂和非分裂细胞

    分裂和非分裂细胞

    与宿主基因组相互作用

    非整合

    非整合

    整合

    外源基因表达时间

    瞬时

    潜在长效

    长效

    包装容量

    7.5kb

    4.5kb

    6kb

    免疫原性

    非常低

    病毒滴度

    10E11(未纯化)

    10E7(未浓缩)

    10E7(未浓缩)

    转染效率

    100%

    70%

    70%

    外源基因表达量

        

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