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《Molecular Cell》‖ 维真AAV与自噬研究和脂代谢




1. 研究背景

 

自噬是细胞中高度保守的生物学现象,能在脂代谢过程中扮演着重要角色。Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(PI3KC3)在自噬过程中发挥着重要功能。作为PI3KC3的亚基之一,Pacer在提高PI3KC3激酶活性和自噬水平方面均能起到重要的作用,Pacer是孙启明课题组新近鉴定的一个脊椎动物特有的自噬调控分子,相关工作2017年发表在Mol Cell杂志上。最近的研究显示,Pacer存在磷酸化和乙酰化的修饰,本研究旨在研究Pacer对肝脏脂质水平以及自噬发展的影响。



2. 研究思路

 

首先,研究者利用腺相关病毒实现Pacer及其突变体在肝脏组织中的表达,分析Pacer磷酸化对小鼠肝脏自噬水平的影响;其次,通过建立非酒精性脂肪肝的小鼠模型,并在建模成功后将注射Pacer的多种乙酰化突变体病毒注射至小鼠体内,观察肝脏的脂质水平以及自噬发展的水平。





3. 部分研究成果


3.1 Pacer磷酸化对小鼠肝脏自噬水平的影响

研究人员采用腺相关病毒腹腔注射的方法,将 AAV-Pacer WT以及Pacer的多种变异体(PacerS157A和Pacer S157D)注射至小鼠体内,并在注射后21天处死小鼠,分析肝脏细胞,检测自噬水平的变化。结果如图1所示:Western blot分析可见,肝脏组织经腺相关病毒感染后,Pacer WT, Pacer S157A和Pacer S157D的表达水平显著增加。



图1. 腺相关病毒介导的Pacer磷酸化变体在肝脏组织中的表达水平及其对自噬基因表达的影响



3.2 Pacer磷酸化对自噬溶酶体形成的影响

结果如图2所示,采用腺相关病毒介导的Pacer磷酸化变体补救Pacer敲降的U2OS细胞,可见过表达Pacer S157A的去磷酸化变体可显著促进自噬溶酶体的形成,而Pacer S157D的永久磷酸化变体则无法促进自噬溶酶体的形成。



图2. 免疫荧光分析腺相关病毒介导的Pacer磷酸化变体对自噬溶酶体形成的影响



3.3 Pacer乙酰化对肝脏组织自噬水平的影响

非酒精性脂肪肝建模成功后,采用维真腺相关病毒在肝脏组织过表达Pacer WT和Pacer 2KR变体,结果如图3所示:可见腺相关病毒介导Pacer及其变体可在肝脏组织中表达。



图3. Western blot分析腺相关病毒介导的Pacer乙酰化变体在肝脏组织中的表达情况



3.4 Pacer乙酰化对肝脏脂质代谢的影响

结果如图4所示,采用高脂饲料喂养建模后采用油红染色和电镜分析,显示肝脏组织和细胞中脂质水平显著增加。而采用腺相关病毒介导Pacer WT可显著降低肝脏组织中脂质水平,腺相关病毒介导Pacer 2KR(乙酰化变体)则无法有效降低肝脏中脂质水平。



图4. 油红染色电子显微镜分析肝脏组织中脂质水平的变化



文章小结:该工作阐明了脊椎生物特有的自噬调控基因Pacer如何感知上游营养信号,进而调控自噬体成熟和肝脏脂代谢的分子机制。这项工作不仅确定了Pacer蛋白是肝脏自噬和肝脏稳态的调控者,而且还揭示了肝脏自噬的后期和脂质代谢中的信号整合机制。《Molecular Cell》(IF:14.248)

 

 

4. 病毒产品及使用方法

 

 

产品名称

血清型

购自

AAV-mCherry-GFP-LC3

AAV9

维真生物

AAV-Vector

AAV9

维真生物

AAV-PacerWT-HA

AAV9

维真生物

AAV-PacerS157A

AAV9

维真生物

AAV-PacerS157D-HA

AAV9

维真生物

AAV-Pacer2KR-HA

AAV9

维真生物

病毒用量:1×10E11 vg/只;  注射方法:100μL PBS稀释后腹腔注射;

 

 

        

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